ALSTEM VB100說明書

ALSTEM是一家位于灣區的早期生物技術公司，擁有快速擴展的產品和服務組合，為生物制藥和學術機構提供服務。受到加利福尼亞干細胞研究承諾的啟發，ALSTEM于2012年由具有iPS細胞重編程和基因組編輯技術專業知識的科學家創立。

ViralBoost Reagent：＃VB100

描述

ViralBoost Reagent（500X）是一種新型的小分子混合物，可以增強病毒的產生，是一種功能強大，廣泛適用于有效病毒包裝的試劑。ViralBoost試劑在轉錄水平上穩定地調節病毒RNA包裝，這可以增加逆轉錄病毒顆粒或慢病毒顆粒的產量高達10倍。易于使用的協議使ViralBoost Reagent非常適合各種規模的病毒包裝。

圖1.來自GFP逆轉錄病毒轉導的HEK 293T細胞的流式細胞術數據，其在不存在和存在ViralBoost試劑的情況下包裝。

圖2.用GFP慢病毒轉導的HEK 293T細胞，其與ViralBoost一起包裝和不包裝

ViralBoost Reagent是一種新型的小分子混合物，用于高滴度病毒的生產，是一種功能強大，廣泛適用于有效病毒包裝的試劑。它穩定地調節轉錄水平上的病毒RNA包裝，這可以大大增加逆轉錄病毒顆粒或慢病毒顆粒的產量，多可達10倍。易于使用的協議使ViralBoost Reagent非常適合各種規模的病毒包裝。

第1天：轉染前一天，

1.用1x明膠涂布板/盤30分鐘。吸出明膠，每100mm平板涂3-4~10×10 ⁶ HEK 293T細胞。每塊板使用10毫升培養基。

注意：良好的單細胞懸浮液（胰蛋白酶消化良好）和均勻分布細胞非常重要。

第2天：轉染

注意：按照制造商的協議準備轉染。

2.準備兩個試管，并在每個試管中加入0.5 ml DMEM。在一個試管中，加入DNA混合物（含有病毒載體和包裝混合物）并通過標記管充分混合。在另一個試管中，添加NanoFect（目錄號NF100）。通過標記管混合。

注意：在室溫（20-25°C）下孵育不超過5分鐘。

3.將NanoFect-DMEM混合物轉移到DNA管中，上下移液2-3次。通過渦旋混合5-10秒充分混合。

4.在室溫下孵育約15分鐘，以允許NanoFect / DNA復合物自組裝。

5.將NanoFect / DNA混合物逐滴添加到板上，輕輕搖動板并將板放回培養箱中

第3天：更改培養基并添加ViralBoost

6.用10ml新鮮培養基替換上清液，并補充20μlViralBoost（500X）。將平板放回細胞培養箱中。

第4天：收集病毒

！小心小心處理病毒材料并避免溢出。使用漂白劑凈化有害液體（10％終濃度30分鐘）。

7.將上清液收集在50ml錐形管中并置于冰上。將上清液以1,000g離心10分鐘以除去細胞碎片。（將離心機預設為4°C）

8.通過0.45μm過濾器過濾上清液。將過濾的上清液轉移至無菌容器中，并向每4體積含病毒的上清液中加入1體積的冷逆轉錄病毒/慢病毒沉淀溶液（4℃，目錄號VC100和VC200）。（例如：5ml逆轉錄病毒/慢病毒沉淀溶液，含20ml病毒上清液）。

9.充分混合并冷藏過夜。

第5天：濃縮病毒

10.在4℃下以1500g離心混合物30分鐘。離心后，病毒顆粒可能在容器底部顯示為米色或白色顆粒。

11.丟棄上清液。通過以1500g離心5分鐘來旋轉殘留溶液。通過抽吸去除所有的液體痕跡，小心不要打擾顆粒中沉淀的病毒顆粒。

12.使用冷的無菌PBS或DMEM在4℃下以1/10至1/100的原始體積重懸病毒顆粒。在低溫小瓶中等分并儲存在-80°C直至準備使用。

注意：可以使用病毒濃縮/純化程序去除ViralBoost Reagent。當直接用于轉導HEK 293T細胞時，尚未檢測到具有ViralBoost試劑的粗病毒顆粒對目的基因表達的副作用，但是從細胞系到細胞系可能是不同的。建議事先測試ViralBoost對靶細胞的影響。

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