<span id="i5rnx"><optgroup id="i5rnx"></optgroup></span>
陽離子脂質體傳統(tǒng)上用于傳遞遺傳物質，例如各種類型的DNA（pDNA，cDNA，CpG DNA，寡核苷酸，反義寡核苷酸等），各種類型的RNA（例如siRNA，mRNA等）和核酸酸模擬物（NAM）。 將DNA封裝到常規(guī)的中性帶電荷的基于PC的脂質體中可能是一個技術問題，主要是由于質粒的大小。由于這個問題在80年代后期，已經(jīng)開發(fā)了由陽離子脂質和PE組成的脂質體。這個想法是用陽離子脂質的正電荷中和pDNA的負電荷，以便主要由于靜電相互作用有效地捕獲更多質粒并將其傳遞到細胞中。通常，該程序僅基于將陽離子脂質體與DNA或RNA混合并將其添加到細胞中即可。這導致骨料的配方。
為了設計合適的陽離子脂質用于基因傳遞，已將兩種方法用于陽離子脂質合成：1）基于膽固醇的設計，例如DC-膽固醇和GL-67脂質，以及2）非基于膽固醇的設計，例如作為DOTAB，DDAB和DOTMA。 為了使用脂質體在體外成功轉移基因，應考慮一些因素： i）結合和包裝脂質體中DNA / RNA的能力； ii）包裝的DNA / RNA與細胞表面的相互作用； iii）DNA / RNA內在化的效率； iv）萬一發(fā)生內吞作用，從內體釋放細胞內DNA； v）細胞核中的轉基因表達水平。 已根據(jù)其在酸性條件下釋放其含量的趨勢設計了對pH敏感的脂質體。主要概念基于病毒，該病毒通過pH 5-6的蛋白質與內體膜融合，并在到達溶酶體之前將其遺傳物質傳遞到細胞質中。 通常，pH敏感脂質體由二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE）組成。由于磷脂酰乙醇胺（PE）在酸性條件下會發(fā)生變化，因此據(jù)信它可以充當膜融合促進劑。 脂質體與細胞之間相互作用的有效性高度依賴于脂質體組合物。脂質體通過各種內吞過程捕獲，效率取決于細胞類型和脂質體大小。各種大小和電荷的脂質體可通過吞噬作用附著于巨噬細胞和嗜中性粒細胞。脂質體附著到細胞表面后，由于早期內體的酸性更高（6.50），內化進入內體。通過成熟或囊泡融合將脂質體轉移到酸性更高的pH（5.5-6.0）的后一個內體，這需要10-15分鐘。攝取后二十分鐘（或更長時間），內含物被遞送至pH 5.0或更低的溶酶體。溶酶體是內吞途徑中主要的降解和后的內吞區(qū)段，pH不敏感的脂質體在其中積累和降解。但是，在pH敏感脂質體滲透到細胞中后，不會發(fā)生積累和降解。
有關上述脂質體脂質組成的更多信息，請單擊此處。
| 緩沖液和脂質體大小 | 規(guī)格 |
|---|---|
| 緩沖 | 去離子無核糖核酸水 |
| pH值 | 7 |
| 脂質體大小 | 100納米 |
| 熒光染料 | 激發(fā)/發(fā)射（nm） | 分子結構 |
|---|---|---|
| 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-（7-硝基-2-1,3-苯并惡二唑-4-基）（銨鹽） | 460/535 |  |
| 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-（lissamine羅丹明B磺酰基）（銨鹽） | 560/583 |  |
基于陽離子胺氮（在陽離子脂質中）和DNA磷酸基團濃度計算正負電荷之比。DNA和RNA是核苷酸的聚合物。它們通過磷酸二酯鍵（一種特定類型的共價鍵）結合在一起，該磷酸二酯鍵可以長到數(shù)百萬個核苷酸。由于存在構成每個核苷酸的磷酸根基團（戊糖+含氮堿基+磷酸根），DNA和RNA帶負電。當形成磷酸二酯鍵的一部分時，它們保留2個負電荷中的1個。失去另一個負電荷以形成與新戊糖的另一個酯鍵。這就是將該鍵稱為“磷酸二酯”的原因。例如，陽離子脂質DC-膽固醇具有以下結構。
DC-膽固醇具有兩個氮原子，但是靠近羧基的氮不是帶正電的。DC-膽固醇僅包含一個可質子化的氮原子。因此，每個分子有一個正電荷。1 nmol的DC-膽固醇可貢獻1 nmol的正電荷。對于其他脂質，請查看其分子結構以找到分子中的氮原子數(shù)。
RNA與DNA不同，是單鏈分子。但是，siRNA是雙鏈的。例如，在一個長21 bp的siRNA分子中，由于堿基對中有2個核苷酸，并且每個核苷酸帶有一個負電荷，因此存在42個負電荷。
1 µg DNA可產(chǎn)生3.1 nmol帶負電的磷酸鹽。
魚精蛋白是一種高度帶正電荷的聚陽離子肽，分子量為5.1 kDa，可作為DNA縮合試劑。已知魚精蛋白是精子核中用于濃縮DNA的主要成分。所有魚精蛋白都含有精氨酸，并且是強堿性的（等電點= 11-12）。
由脂質魚精蛋白-DNA（LPD）組成的脂質多聚體是通過魚精蛋白預壓縮的DNA與陽離子脂質體的結合而產(chǎn)生的。這與通過陽離子脂質和DNA之間直接靜電相互作用形成的陽離子脂質體-DNA脂質復合物相反。脂質魚精蛋白-DNA具有凈正表面電荷，據(jù)信對于其與陰離子細胞表面蛋白聚糖的結合是*的。細胞表面的這種靜電相互作用觸發(fā)脂質-DNA復合物的內吞作用進入細胞。
向DNA和陽離子脂質體中添加魚精蛋白的順序非常重要。一種方案涉及將質粒DNA與硫酸魚精蛋白預復合，然后添加陽離子脂質體。該協(xié)議有兩個缺點。其中之一是需要大量過量的陽離子脂質才能實現(xiàn)大水平的基因表達。通常，陽離子脂質/ DNA摩爾比必須大于35，才能有效體內轉染。另一個問題是難以制備濃縮樣品。這是由于魚精蛋白硫酸鹽與質粒DNA的強烈相互作用，這使得高濃度魚精蛋白/ DNA復合物的制備變得困難，尤其是在需要高魚精蛋白/ DNA比（w / w）的情況下。為了解決這些問題，已經(jīng)開發(fā)了第二種方案，其中將硫酸魚精蛋白與陽離子脂質體混合，然后添加質粒DNA。由于陽離子脂質體和魚精蛋白之間競爭與質粒DNA的相互作用，大大降低了魚精蛋白和DNA之間的強相互作用。在一定條件下，這將導致形成平均直徑小于150 nm的LPD。
為了計算正負比率，您需要考慮：
聚乙二醇化已在脂質體學領域廣泛使用了數(shù)十年。聚乙二醇化的好處是*的，包括改善脂質復合體的系統(tǒng)循環(huán)。然而，脂質復合體的PEG化的缺點也已經(jīng)被很好地證明。這包括防止脂質復合物與靶細胞締合以及抑制DNA從內體區(qū)室釋放，這導致非常低的轉染效率。
隨著摻入陽離子脂質體中的PEG化脂質的分子量增加，陽離子脂質體的細胞毒性增加。例如，含有PEG5000的脂復合物比含有PEG2000的脂復合物更具細胞毒性。陽離子脂質體的轉染活性隨PEG-DSPE脂質百分比的增加而降低。先前的研究表明，添加0.5％，1％和2％的PEG-PE分別將其活性降低至肺部原始熒光素酶活性的60％，40％和10％。還已經(jīng)報道將PEG-PE（1％的陽離子脂質）添加到新形成的質粒-脂質體復合物中可以防止復合物在儲存期間聚集。但是，將含有PEG-PE的復合物在4°C下儲存會緩慢恢復其原始活性。一般來說，聚乙二醇化不用于轉染實驗。但是，特別是在某些實驗中體內實驗使用聚乙二醇化脂復合物。
如果您需要進行涉及陽離子脂質體聚乙二醇化的實驗，則強烈建議先將適量的遺傳物質添加到脂質體中，然后再在外部添加聚乙二醇化脂質（插入后）并孵育脂質體，以形成脂質復合物。然后將PEG脂質在高于陽離子脂質的液相到凝膠相變溫度的溫度下放置一小時（如果是不飽和陽離子脂質，例如DOTAP，則可以在室溫下孵育）。
在許多實驗中，由于不使用傳統(tǒng)的PEG2000-DSPE，而是使用C8-PEG2000-神經(jīng)酰胺對脂質復合物進行PEG化，因為PEG-神經(jīng)酰胺是一種“脫落的PEG”，在與生物膜接觸時會從脂質復合物中擴散出去。
由于脂質體制劑中使用的陽離子脂質具有細胞毒性，因此強烈建議進行細胞生存力分析。可以通過改良的Alamar藍分析法評估細胞活力。阿拉瑪藍含有氧化還原指示劑，該指示劑在細胞代謝的氧化還原范圍內均顯示熒光變化。簡而言之，將10μL的10％（v / v）Alamar藍色染料添加到100μL樣品中。在37ºC下孵育2小時后，在熒光分光光度計上在570 nm和600 nm上讀取所得的熒光。使用以下公式計算細胞生存力（對照細胞的百分比）：
PlainGenesome®是由納米級單層脂質體制成的白色半透明液體。FluorescentGenesome®制劑帶有顏色，其顏色取決于所用熒光染料的類型（有關外觀，請參見SDS）。通常由于脂質體小，在小瓶底部不會發(fā)生沉淀。將脂質體包裝在琥珀色的小瓶中。
