ezbioscience B0003說(shuō)明書(shū)

EZ-press Cell to cDNA Kit PLUS

產(chǎn)品概述

介紹

EZ-press 細(xì)胞轉(zhuǎn) cDNA 試劑盒 PLUS 提供了一種快速簡(jiǎn)便的方法，無(wú)需分離 RNA 即可從培養(yǎng)細(xì)胞中生產(chǎn) cDNA。該試劑盒生成的cDNA適用于基因克隆和基因表達(dá)的定量分析，因此是TRIzol方法的良好替代品。

與TRIzol方法相比，該試劑盒具有以下幾個(gè)顯著優(yōu)勢(shì)：

1.易于使用。從培養(yǎng)的細(xì)胞開(kāi)始，只需兩個(gè)步驟（細(xì)胞裂解和逆轉(zhuǎn)錄）即可合成高質(zhì)量的cDNA，無(wú)需RNA分離。

2.快速。整個(gè)實(shí)驗(yàn)（從細(xì)胞到cDNA）可以在不到25分鐘的時(shí)間內(nèi)完成。

3.穩(wěn)定，可重復(fù)性強(qiáng)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，總RNA被wan美保留，從而獲得穩(wěn)定且高度可重復(fù)的結(jié)果。

4.靈敏度高。靈敏度高。每個(gè)樣品的檢測(cè)下限僅為100個(gè)細(xì)胞。

5. 沒(méi)有基因組DNA殘留。基因組DNA的去除比以前的版本更充分。此外，該試劑盒中使用的試劑安全無(wú)毒，與臭味和危險(xiǎn)的TRIzol試劑相比，這是令人愉快的。

與EZ-press細(xì)胞轉(zhuǎn)cDNA試劑盒相比，模板RNA可以通過(guò)乙醇沉淀從細(xì)胞裂解物中收集，溶解在ddH 2 O中。然后可以通過(guò)分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，例如Nanodrop。因此，在隨后的RT反應(yīng)中，每個(gè)樣品中可以等量的RNA用作模板。此外，EZ-press細(xì)胞到cDNA試劑盒PLUS具有更高的RT效率。該試劑盒進(jìn)行的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)僅需15min即可完成。

實(shí)驗(yàn)程序一覽

細(xì)胞裂解液解凍細(xì)胞裂解

緩沖液，倒置或輕彈試管數(shù)次以徹di混合（不要使用渦旋），然后將試管放在冰上。

1A.對(duì)于細(xì)胞數(shù)小于3×105/樣品的貼壁細(xì)胞：

a） 從孔中吸出培養(yǎng)基。

b）用PBS（200μl/孔）洗滌孔。在不干擾細(xì)胞的情況下盡可能wan全去除PBS。

c） 以 80 μl 細(xì)胞裂解緩沖液/1×105個(gè)細(xì)胞的比例向每個(gè)樣品添加細(xì)胞裂解緩沖液，輕輕上下移液 10 次以裂解細(xì)胞。您應(yīng)該將 160ul 細(xì)胞裂解緩沖液添加到 2×105個(gè)細(xì)胞中）。

d）立即將4μl細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移到新管中，加入0.8μlgDNA去除劑并輕輕混合。在25°C孵育5分鐘。

1B.對(duì)于細(xì)胞數(shù)大于3×105/樣品或懸浮細(xì)胞的貼壁細(xì)胞：

a）（僅適用于貼壁細(xì)胞，對(duì)于懸浮細(xì)胞，從步驟b開(kāi)始）使用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)采用的傳代培養(yǎng)方法分離細(xì)胞。

b）計(jì)數(shù)然后輕輕沉淀細(xì)胞，丟棄生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

c） 通過(guò)將細(xì)胞重懸于每 1×105個(gè)細(xì)胞的 ~0.1 mL PBS 中來(lái)洗滌 PBS 中的細(xì)胞。

d）將一定量的細(xì)胞（~1×105）轉(zhuǎn)移到每個(gè)樣品的新1.5ml離心管中，以低速（~1000rpm，5min）離心細(xì)胞，然后小心地吸出PBS，而不會(huì)干擾細(xì)胞沉淀。

e） 向每個(gè)樣品中加入 80 μl 細(xì)胞裂解緩沖液，輕輕上下移液 10 次以裂解細(xì)胞。

f）立即將4μl細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移到新管中，加入0.8μlgDNA去除劑并輕輕混合。在25°C孵育5分鐘。

2.將裂解物放在冰上，在30分鐘內(nèi)進(jìn)行RT反應(yīng)。

注意：1.80μl細(xì)胞裂解緩沖液的容量約為1×105個(gè)細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型而變化。為了獲得最佳結(jié)果，強(qiáng)烈建議進(jìn)行試點(diǎn)實(shí)驗(yàn)以確定每次裂解的最佳細(xì)胞數(shù)。

2.在96、48、24和12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)的細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)不超過(guò)3×105，可在PBS洗滌后直接用于裂解。當(dāng)處理超過(guò)3×105 /孔（或培養(yǎng)皿）的細(xì)胞時(shí)，請(qǐng)遵循程序1B：必須首先分離細(xì)胞（步驟a）。然后，將細(xì)胞培養(yǎng)基加入胰蛋白酶分離的細(xì)胞中，計(jì)數(shù)，低速離心并棄去上清液（步驟b），用適當(dāng)體積的PBS重懸（步驟c），然后取~1×105個(gè)細(xì)胞/樣品用80μl細(xì)胞裂解緩沖液裂解（步驟d）。

3.細(xì)胞裂解物與任何其他常用的RT試劑不相容（使用其他RT試劑無(wú)法產(chǎn)生或很少的cDNA）。因此，必須使用該試劑盒中提供的特殊優(yōu)化的RT試劑對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

產(chǎn)品詳情

名稱(chēng)      EZ-press Cell to cDNA Kit PLUS

編號(hào)     B0003

品牌     ezbioscience