雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（高敏型）說(shuō)明書(shū)

     上海起發(fā)生物科技有限公司（Shanghai BioHub Biotechnology Co., Ltd.）屬于上海起發(fā)實(shí)驗(yàn)試劑有限公司（2009年成立）旗下的子公司，成立的初衷是建立上海起發(fā)生物自有品牌，打造優(yōu)質(zhì)的生物試劑民族自有品牌。降低成本的同時(shí)，把好生物產(chǎn)業(yè)鏈中的國(guó)產(chǎn)生物試劑品質(zhì)關(guān)。未來(lái)讓每一個(gè)和我們一樣擁有民族情懷的企業(yè)，共同創(chuàng)世界優(yōu)秀的中國(guó)生物制造企業(yè)，圓夢(mèng)中國(guó)。
產(chǎn)品詳情

產(chǎn)品描述

報(bào)告基因檢測(cè)常用于研究真核生物基因表達(dá)調(diào)控，螢火蟲(chóng)螢光素酶和海腎螢光素酶可以分別催化底物螢光素(luciferin)和腔腸素(coelenterazine)發(fā)出生物螢光(bioluminescence)，這種發(fā)光反應(yīng)具有良好的光學(xué)特征和濃度線性范圍，同時(shí)檢測(cè)的靈敏度高，可達(dá)到 10-20mol。兩種催化反應(yīng)最適濃度不同，因此互不干擾，配合使用形成一套高靈敏的雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)，其中海腎螢光素酶常作為內(nèi)參照。

 螢火蟲(chóng)螢光素酶是一種分子量約為 61 kDa 的蛋白，在 ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下，催化 luciferin 氧化成 oxyluciferin，在此過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生發(fā)射波長(zhǎng) 560 nm 的生物螢光。海腎螢光素酶是一種分子量約為36 kDa的蛋白，在氧氣存在條件下，催化腔腸素(Coelenterazine) 氧化成 coelenteramide，在此過(guò)程中會(huì)發(fā)出波長(zhǎng)約為 480 nm 的生物螢光。在后加入海腎螢光素酶底物時(shí)，可有效淬滅螢火蟲(chóng)熒光素酶催化 luciferin 的發(fā)光，而不干擾海腎螢光素酶的活性，從而實(shí)現(xiàn)雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)。生物螢光可以通過(guò)化學(xué)發(fā)光儀(luminometer)或) 或多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)螢光素酶與其底物催化發(fā)光的體系，可以高效、靈敏地檢測(cè)目的基因的表達(dá)。

產(chǎn)品組分

使用方法

使用方法

1. 試劑準(zhǔn)備：

（1）1x Universal lysis Buffer 配置：取所需體積的 5x Universal lysis Buffer 臨用前用三蒸水稀釋至 1x 用；

（2）Fluc buffer A 工作液：試劑盒開(kāi)啟時(shí)，將 Fluc buffer A 全部加入到 Fluc substrate中，適當(dāng)吹打搖勻至粉末充分溶解后分裝到棕色管中-20℃保存?zhèn)溆茫?/span>

（3）Rluc Buffer B 工作液：臨用前取 50x Rluc substrate 用 Rluc Buffer B 稀釋至 1x 用（按需配置），配置好的 Rluc Buffer B 工作液在 2-3 h 內(nèi)使用有效。（試劑配置過(guò)程中注意避光）

2. 細(xì)胞裂解物制備:

棄去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，加入足量 PBS 清洗一遍，細(xì)胞刮刮取收集沉淀(如為懸浮細(xì)胞直接離心棄上清收集沉淀)。細(xì)胞沉淀可-80℃保存，也可立即加入適量 1x Universal lysis Buffer 吹打混勻，液氮凍融三次，制備細(xì)胞裂解物。

細(xì)胞裂解液推薦使用量：

3. 螢光數(shù)值檢測(cè)：

（1）熒光酶標(biāo)儀設(shè)定， 選擇生物發(fā)光檢測(cè)功能，根據(jù)本批樣本的靈敏度選擇合適增益與積 分時(shí)間，默認(rèn)為增益 135，積分時(shí)間 10 s。

（2）檢測(cè)：

1) 移液槍吸取細(xì)胞裂解液 20 μL 到黑色孔板底部（充分混勻裂解物）；

2) 加入 100 μL Fluc buffer A，移液器輕柔快速吹打混勻三次，立即啟動(dòng)檢測(cè)，記錄發(fā)光值 （F 值）；

3)加入 100 μL Rluc buffer B，移液器輕柔快速吹打混勻三次，立即啟動(dòng)檢測(cè)，記錄發(fā)光值（R 值）。（因手動(dòng)控制檢測(cè)會(huì)導(dǎo)致時(shí)間誤差較大，對(duì)結(jié)果有一定的影響，建議配備計(jì)時(shí)器，保證不同 樣本之間反應(yīng)和檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)基本一致)

4.數(shù)據(jù)分析：

（1）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，每組實(shí)驗(yàn)均應(yīng)設(shè)置空白對(duì)照組，對(duì)照組和處理組。

a.空白對(duì)照組

背景 F：未轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液+ Fluc buffer A。

背景 R：未轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液+ Fluc buffer A + Rluc buffer B。

注：空白對(duì)照組樣品量須與實(shí)驗(yàn)樣品量相同，且與實(shí)驗(yàn)樣品含有相同的培養(yǎng)基/血清組合。

b. 對(duì)照組：轉(zhuǎn)染細(xì)胞未經(jīng)實(shí)驗(yàn)因素處理 (即對(duì)照組 F 和對(duì)照組 R)。

c. 實(shí)驗(yàn)組：轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)實(shí)驗(yàn)化合物處理 (即實(shí)驗(yàn)組 F 和實(shí)驗(yàn)組 R)。

計(jì)算結(jié)果：對(duì)照組比值=(對(duì)照組 F-背景 F)/(對(duì)照組 R-背景 R)，

實(shí)驗(yàn)組比值=(實(shí)驗(yàn)組 F-背景 F）/(實(shí)驗(yàn)組 R-背景 R)。

表達(dá)倍數(shù)=實(shí)驗(yàn)組比值/對(duì)照組比值。

圖 2.熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒操作示意圖

實(shí)驗(yàn)案例分析

在六孔板中接種適量細(xì)胞過(guò)夜至貼壁狀態(tài)，第二天用新鮮的空白培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞 4h 后共轉(zhuǎn)三個(gè)質(zhì)粒：

1.含有法尼醇 X 受體（FXR）啟動(dòng)子區(qū)的熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體質(zhì)粒；

2.含有 FXR 啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子 E2 功能區(qū)的表達(dá)載體質(zhì)粒；

3.海參熒光素酶重組表達(dá)載體質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染 6h 后更換為含有不同藥物濃度的鵝去氧膽酸（Chenodeoxycholic acid，CDCA）和奧貝膽酸（Ocaliva，OCA）和Complete culture solution培養(yǎng)細(xì)胞 48h，最后按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作刮收沉淀，隨后立即裂解進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)，結(jié)果如下:

圖 3（左）兩個(gè)濃度（10μM，20 μM）CDCA 藥物處理下，FXR 啟動(dòng)子區(qū)熒光素酶報(bào)告基因激動(dòng)倍數(shù)圖；

 （右）兩個(gè)濃度（10μM，20 μM）OCA 藥物處理下，FXR 啟動(dòng)子區(qū)熒光素酶報(bào)告基因激動(dòng)倍數(shù)圖

 （紅色：起發(fā)生物品牌產(chǎn)品測(cè)定結(jié)果；黃色：進(jìn)口“P"品牌產(chǎn)品測(cè)定結(jié)果）。

注意事項(xiàng)

（1）反應(yīng)溫度：酶促反應(yīng)對(duì)溫度較為敏感，加樣檢測(cè)前務(wù)必將檢測(cè)試劑以及細(xì)胞培養(yǎng)液平衡至室溫（20-25℃）。

（2）檢測(cè)儀器：能檢測(cè)化學(xué)發(fā)光的儀器都適用，但由于不同儀器的設(shè)置和靈敏度不同，測(cè)得的光信號(hào)值也會(huì)不同。

   檢測(cè)板：為防止孔間干擾，推薦使用不透光酶標(biāo)板。

（3）發(fā)光信號(hào)會(huì)受到檢測(cè)環(huán)境如培養(yǎng)基組分、溫度等影響，應(yīng)確保同組內(nèi)不同樣本檢測(cè)條件一致。

（4）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套。

（5）本產(chǎn)品僅作科研用途！