支原體基因組DNA提取試劑盒（離心柱法）說明書
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產品詳情
貨號 | 規格 | 價格 |
78EA10019-50T | 50T | ￥1200.00 |
產品描述
《支原體基因組 DNA 提取試劑盒》（離心柱法）（Mycoplasma Genomic DNA Extraction Kit with Columns）的操作方法和試劑配方已經針對支原體的特點做了優化，專門用于從體外培養的細胞、細胞上 清、血清、血漿、全血、生物制品等樣品中提取支原體基因組 DNA。提取的支原體基因組 DNA 可用于《一 步法恒溫支原體檢測試劑盒》、《PCR 法支原體檢測試劑盒》和《探針法支原體檢測試劑盒》。
支原體基因組 DNA 的提取有兩個作用：
（1）可以去除所有可能抑制 PCR 擴增的成分或者干擾《一步法 恒溫支原體檢測試劑盒》顯色的成分，保證后續 PCR 擴增的正常進行或者《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》 的顯色不被干擾；
（2）具有濃縮支原體 DNA 的作用，可以提高相對檢測靈敏度 10-100 倍。
產品組分
蛋白酶 K 溶液：Proteinase K（20 mg/mL） 1 mL
溶液 GR：Buffer GR 15 mL
溶液 GL：Buffer GL 15 mL
清洗液 GW1：Buffer GW1(Concentrate) 13 mL
清洗液 GW2：Buffer GW2(Concentrate) 15 mL
洗脫液 EB：Elution Buffer EB 15 mL
吸附柱：Spin Columns DM 50 個
收集管：Collection Tube 50 個
使用方法
使用方法
1.實驗前準備及重要注意事項
1) Buffer GW1 和 Buffer GW2 的配制：第一次使用前，應按照試劑瓶標簽的說明先在 Buffer GW1 和 Buffer GW2 中加入無水乙醇，并在試劑瓶標簽中做好標記。
2) 使用前請檢查 Buffer GL 是否出現結晶或者沉淀，如有結晶或者沉淀，請將 Buffer GL 于 56?C 水 浴孵育重新溶解。
2. 樣品處理：本試劑盒優選體外培養的細胞上清（貼壁細胞直接取細胞培養上清、懸浮培養細胞取低速 離心后的離心上清）、血清、血漿、溶液型生物制品作為提取支原體基因組 DNA 的樣品。如果是粉末 型樣品，需用水溶解后，再進行后續操作。
注 1：體外培養的貼壁細胞培養上清或懸浮細胞，經 1200 rpm（約 150 g）低速離心 5 分鐘后（切 記：此步驟離心力不能太大，否則支原體會被離心去除了！），取離心后上清進行檢測。
注 2：如果初始樣品是加了抗凝劑的全血，經 1200 rpm（約 150 g）低速離心 10 分鐘后（切記： 此步驟離心力不能太大，否則支原體會被離心去除了！），取上層血漿進行檢測。
注 3：如果初始樣品是未加抗凝劑的全血，待血液凝固后，取血清進行檢測。
3. 取上述細胞上清、血清、血漿、生物制品等樣品 200 μL，用移液槍吹吸均勻后，進行后續操作。
注 1：當樣品量小于 200 μL 時，加入 Buffer GR 補足至 200 μl，再進行下一步實驗。
注 2：如果預期待測樣品支原體含量較少（比如長期低溫保存的血清、血漿、胰酶、生物制品等）， 可以取上述樣品 1 mL，加入 1.5 mL 離心管內，13000 rpm（約 16000 g）高速離心 5 分鐘。吸走 離心后的上清 800 μL，剩余 200 μL 用移液槍吹吸均勻后，進行后續操作。此步驟起濃縮支原體的 作用，從而提高支原體檢測的相對靈敏度。如果需要，上述樣品的體積可以進一步放大，經過多 次高速離心后，剩余 200 μL 用于后續操作（比如，如果初始體積是 5 mL，經 5 次高速離心，取剩 余的 200 μL 進行后續操作，最終用 50 μL 洗脫液進行洗脫，則支原體 DNA 大約濃縮了 100 倍，支 原體檢測的相對靈敏度也大約提高了 100 倍。）
4. 向以上溶液中加入 20 μL Proteinase K（20 mg/mL）溶液，混勻。
5. 加入 200 μL Buffer GL（如果室溫較低，使用前請檢查 Buffer GL 是否出現結晶或者沉淀，如有結晶 或者沉淀，請將 Buffer GL 于 56?C 水浴孵育重新溶解），用吸頭充分吹吸均勻或用 Vortex 充分震蕩。
注意：不要將 Proteinase K 和 Buffer GL 進行預混，否則 Proteinase K 可能失活。
6. 將離心管放置 56?C 水浴，孵育 15 分鐘。
注意：此步驟不能省略！
7. 加入 2 μL 支原體 qPCR 內參質粒 mycoIC2（注意：內參質粒 mycoIC2 請吹吸均勻后，再加入。內參質粒 mycoIC2 只在本公司《探針法支原體檢測試劑盒》內含有，如果使用其他支原體檢測方法，本步驟可以 跳過！）。
注 1：此步驟只有使用本公司《探針法支原體檢測試劑盒》時，需要加入支原體 qPCR 內參質粒 mycoIC2。
注 2：加入的內參質粒 mycoIC2 用于監控支原體 DNA 的提取和后續支原體 qPCR 的擴增是否有效。
8. 加入 200 μL 無水乙醇，上下顛倒混勻數次。 l 注意：此處不能高速離心！如果需要（一般不需要離心），只能 1000 rpm（約 100 g）低速短暫 離心（20 Sec），使管壁和壁蓋上的液體集中到管底。
9. 用 1 mL 吸頭將所得溶液全部（含管壁和蓋子上溶液）加入到已裝入收集管的吸附柱(Spin Columns DM） 中。12,000 rpm 離心 1 分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
10.向吸附柱中加入 500 μL Buffer GW1（使用前檢查是否加入無水乙醇!）,蓋上蓋子，將吸附柱快速顛倒 一次（目的：清洗管壁和蓋子中的雜質），12,000 rpm 離心 1 分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱 重新放回收集管中。
11.向吸附柱中加入 500 μL Buffer GW2（使用前檢查是否加入無水乙醇!），蓋上蓋子，將吸附柱快速顛 倒一次（目的：清洗管壁和蓋子中的雜質），12,000 rpm 離心 1 分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附 柱重新放回收集管中。
12.再次清洗：向吸附柱中加入 600 μL Buffer GW2（使用前檢查是否加入無水乙醇!），蓋上蓋子，將吸附柱快速顛倒一次（目的：清洗管壁和蓋子中的雜質），12,000 rpm 離心 1 分鐘，倒掉收集管中的廢 液，將吸附柱重新放回收集管中。
13.繼續 12,000 rpm 離心 2 分鐘。離心后，在亮光下，仔細檢查吸附柱內部吸附膜上方的塑料墊圈四周是 否有液體殘留。如果發現吸附柱內部塑料墊圈四周有液體殘留，可以將吸附柱放回收集管內，將有液 體殘留的一側放在離心力內側，繼續 12,000 rpm 離心 1 分鐘。
14.離心后，經仔細檢查，如果確認吸附柱內部塑料墊圈四周沒有液體殘留，則可以丟棄收集管，將吸附柱 置于一個新的 1.5 mL 離心管（自備）中，打開吸附柱蓋子，置于 50-65℃的烘箱內放置至少 15 分鐘， 以讓吸附膜中的乙醇揮發干凈（請務必放在 50-65℃的烘箱內放置！如果室溫放置，不僅時間需要 延長，還不排除有些樣品由于乙醇揮發不干凈，影響后續 PCR 擴增效率，甚至失敗）。
注意：打開吸附柱蓋子，將吸附柱放在 50-65℃的烘箱內至少 15 分鐘，此步驟非常關鍵！如果沒 有烘箱，強烈建議購買一個。這一步的目的是將吸附膜中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會嚴 重影響后續的酶促反應（如：酶切、PCR 擴增等），甚至可能導致后續的 PCR 失敗。
15.向吸附柱的中間部位懸空加入 50 μL Elution Buffer EB，室溫放置 3 分鐘，12,000 rpm 離心 1 分鐘， 收集 DNA 溶液，-20℃保存。
運輸及保存方法
該產品常溫運輸，室溫保存（收貨后，其中的 Proteinase K 放-20?C 保存）。該條件下，至少 3 年內有 效。Proteinase K 溶液可以在室溫保存 2-3 個月，長期保存需要放-20?C。
