Phusion高保真聚合酶中的戰(zhàn)斗機(jī)

 如果PCR產(chǎn)物需要進(jìn)行后繼的克隆表達(dá)研究，需要進(jìn)行高保真度PCR以減少PCR過程中出錯而造成的點(diǎn)突變，我們通常會選擇高保真DNA聚合酶。一般的高保真DNA聚合酶因?yàn)楸旧淼男ｒ?yàn)功能注定了效率低，產(chǎn)量低，條帶弱，時間慢。的高保真酶Pfu的效率大概只有Taq酶的1//5。常有人感嘆“又貴又不好用（指產(chǎn)量低）”！為了提率，有些公司又推出了混合酶，將Taq與帶校驗(yàn)功能的DNA聚合酶混合，中庸的結(jié)果就是效率不如Taq酶，保真度不如Pfu，一般就比Taq高3倍，價格還不便宜。

Finnzymes公司獨(dú)辟蹊徑，將雙鏈DNA結(jié)合蛋白（紫色）與一種新型的具有校對功能的類熱球菌酶（綠色）融合，形成了一種*的高性能聚合酶——Phusion® DNA聚合酶。這下，兩個問題都解決了。

 
圖1. Phusion DNA聚合酶的*結(jié)構(gòu)

快人一步

由于這項*的融合技術(shù)，Phusion DNA聚合酶合成DNA的速度和準(zhǔn)確度是以往任何單一酶都難以企及，即使是zui復(fù)雜的模板，也能準(zhǔn)確、快速地完成反應(yīng)。與其他酶相比，Phusion DNA聚合酶在每次與DNA的結(jié)合反應(yīng)中都能夠摻入更多的核苷酸，其高處理能力大大縮短了延伸步驟的時間，進(jìn)而加快了整個反應(yīng)的進(jìn)行。它的延伸速度是Pfu酶的10倍，比Taq酶還要快一倍，達(dá)到15-30秒/kb。如果你還想更快，可以選擇Phusion® Flash快速高保真聚合酶，每kb 堿基的延伸時間僅為15 秒或更少，反應(yīng)時間zui短，酶的用量顯著低于其他常見的聚合酶。Phusion DNA聚合酶的高速度和率使得它能在zui短時間內(nèi)獲得大量產(chǎn)物。

Finnzymes曾做過實(shí)驗(yàn)，從Thermus sp.基因組文庫中隨機(jī)挑選16個克隆，并用3種不同的耐熱DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示，Phusion® DNA聚合酶具有強(qiáng)勁的性能和速度，它能夠成功擴(kuò)增出隨機(jī)挑選的16個片段中的15個（94%），并且產(chǎn)量很高。而Pfu DNA聚合酶的成功率僅為56%，Taq DNA聚合酶成功率也才62%，二者的產(chǎn)量明顯低于Phusion® DNA聚合酶。而且從圖中可以看出，Phusion® DNA聚合酶的延伸時間和酶用量均顯著低于Pfu酶，與Taq相當(dāng)，但產(chǎn)量更高。如此強(qiáng)勁的性能，無出其右。

 
圖2. Phusion DNA 聚合酶集超高保真度、快速和強(qiáng)勁的性能于一體

節(jié)約時間，節(jié)約用量

由于其結(jié)構(gòu)*，Phusion DNA聚合酶的效率非常高。在PCR反應(yīng)中，該酶的用量顯著低于其他常見的聚合酶。研究人員曾使用3種不同的DNA聚合酶擴(kuò)增一個長為3.8kb的人β球蛋白基因。使用Phusion DNA聚合酶不但可成功擴(kuò)增出此3.8kb的基因組片段，且退火和延長步驟僅需1分鐘，明顯快于其他兩種聚合酶。一個單位的Phusion DNA聚合酶所獲得的產(chǎn)物高于5個單位的Pfu DNA聚合酶的產(chǎn)量，比2.5個單位改良的Pfu的產(chǎn)量也高得多。

圖3. 用更少的酶 —— 獲得更多的產(chǎn)物

適用性強(qiáng)

此外，Phusion DNA聚合酶能夠zui大限度地容忍各種PCR抑制劑，因此只需要很少的優(yōu)化步驟就可以進(jìn)行非常的擴(kuò)增。這個特點(diǎn)也催生了的直接PCR。對于血液、組織等多種樣品，甚至是FFPE樣品，無需提取DNA，即可直接開展高保真PCR擴(kuò)增。

Phusion DNA聚合酶有多個版本可供選擇。 除了上面提到的Phusion Flash，還有Phusion熱啟動II高保真DNA聚合酶，其高度特異性和*聚合能力決定了它是熱啟動PCR的理想選擇。幾種酶的特點(diǎn)和產(chǎn)品形式如下：

價格便宜 選擇多樣

Phusion DNA聚合酶性能如此強(qiáng)勁，而價格卻相當(dāng)親民。以Phusion高保真PCR 試劑盒（含除模板引物外其他所需試劑）為例，目錄價只需555元即可進(jìn)行125次反應(yīng)（每次20μl ），單次反應(yīng)成本才4.44元，1878 元即可有500次反應(yīng)，簡直太給力了！
Phusion DNA聚合酶（含酶，緩沖液，Mg離子，DMSO）只要879元/100U，足夠做100次50ul反應(yīng)。要知道PfuUltra目錄價100U的單酶（40次反應(yīng)）也不止1900啊！

Phusion DNA聚合酶還提供其他多種選擇，熱啟動的高保真單酶（1067元/100U），還有針對GC含量豐富模板，或者特別含HF緩沖液的預(yù)混合酶MasterMix系列產(chǎn)品。

更少出錯

更重要的是，Phusion DNA聚合酶是目前市場上保真度zui高的熱穩(wěn)定性聚合酶。使用改良的lacI方法檢測，Phusion DNA聚合酶的錯配率比Taq DNA聚合酶低約50倍, 比Pfu DNA聚合酶低6倍，是高保真PCR的理想選擇。對于研究基因功能，需要從事定點(diǎn)突變，基因克隆和表達(dá)分析等工作來說，Phusion DNA聚合酶無疑是更好的選擇。

Taq酶出錯幾率較高，且平均擴(kuò)增長度不超過3.5kb。而Phusion DNA聚合酶則可擴(kuò)增10kb以上（<20kb）的超長片段，保真度高不容易出錯，再加上擴(kuò)增速度比普通高保真酶快得多，故使用Phusion DNA聚合酶可以有效節(jié)約很多時間。